Проект реализуется в рамках программы "ПРИОРИТЕТ 2030".
Выполняемые в рамках проекта работы будут соответствовать целям Стратегического проекта 4 и КБК 0708 «Прикладные научные исследования в области образования», а именно: - Выполнение коллективом совместной научной лаборатории УрФУ и Института иммунологии и физиологии УрО РАН (ИИФ УрО РАН) “Компьютерная биология и медицина” и участниками консорциума «“Перспективные биомедицинские и химико-фармацевтические технологии для диагностики и терапии социально-значимых заболеваний” фундаментальных и прикладных исследований мирового уровня: –Развитие в УрФУ кадрового потенциала науки, поддержка молодых исследователей, обеспечение массовой вовлеченности ППС в исследовательскую и инновационную деятельность в интересах предприятий региона и базовых отраслей РФ; - Привлечение в УрФУ на работу эффективных российских и иностранных исследователей, как ведущих, так и молодых; - Развитие интеграции УрФУ с академическими институтами.
В реализации данного проекта будет лежать комплексный подход, основанный на применении современных физико-химических, микробиологических, биохимических, иммунологических, молекулярно-биологических и биоинформационных методов. Позволит диагностировать иммунодефицитные состояния на ранней стадии, что обеспечит их своевременную коррекцию, и предотвратит переход в хроническое заболевание.
Создание тестовой биологической модели экспериментального иммунодефицитного состояния у мышей и определение характеристик такого состояния по анализам крови, миелограмме костного мозга
Моделирование иммуносупрессивного состояния. Работа будет выполнена на мышах-самцах линий C3H 3-х месячного возраста, содержащихся в стандартных условиях вивария. Все манипуляции с животными будут осуществляться в соответствии с Директивой Совета ЕС 2010/63/EU и проходить согласование с этическим комитетом ИИФ УрО РАН. Экспериментальный иммунодефицит будет моделироваться путем внутрибрюшинного введения циклофосфамида (Эндоксан®, Бакстер Онкология ГмбХ, Германия), алкилирующего агента, угнетающего гуморальный и клеточный ответ (Emadi, A., Jones, R. J., and Brodsky, R. A. (2009). Cyclophosphamide and Cancer: golden Anniversary. Nat. Rev. Clin. Oncol. 6 (11), 638–647. doi:10.1038/nrclinonc.2009.146; Watters J.W., Kloss E.F., Link D.C., Graubert T.A., McLeod H.L. A mouse-based strategy for cyclophosphamide pharmacogenomic discovery // J Appl Physiol. – 2003. – V. 95. – P. 1352–1360), однократно в дозе 200 мг/кг массы тела животного в виде раствора со стерильным хлоридом натрия 0,9% в концентрации 20мг/мл. Контрольной группе мышей будет вводиться физиологический раствор хлорида натрия 0,9% в аналогичном объеме. Животные будут выводиться из эксперимента на 7 сутки после моделирования иммунодефицита под наркозом (за 15-20 минут до эвтаназии вводится 2 % Ксилазин (1 мл/кг) и Золетил-100 (0,3 мл/кг) внутримышечно). При этом будет производиться замер массы тела до и после воздействия, забор периферической крови из хвостовой вены в пробирку с К3-ЭДТА для проведения гематологического анализа крови и двух бедренных костей для определения клеточности костного мозга и подсчета миелограммы для верификации иммунодефицита.
Исследование гематологических показателей. Подсчет 18 основных гематологических показателей периферической крови будет проведен на автоматизированном анализаторе Mindray BC-2800Vet (Mindray, China), предназначенном для исследования крови животных.
Определение общей клеточности костного мозга и подсчет миелограммы. Подсчёт общего количества миелокариоцитов будет производиться при помощи камеры Горяева. Кроме того, будет проведена дифференцировка миелокариоцитов в мазках костного мозга (не менее 500 миелокариоцитов в каждом препарате). Статистически значимое снижение абсолютных и относительных показателей содержания зрелых иммунных клеток и их предшественников, активности их воспроизведения в костном мозге будет рассматриваться как критерий наличия иммуносупрессии.
Получение образцов плазмы крови у лабораторных животных (мышей). Образцы крови будут забираться у мышей из хвостовой вены под наркозом в предварительно охлажденные пробирки с К3-ЭДТА с дальнейшим центрифугированием при 4 °С 1000 g в течение 15 минут. Аликвоты плазмы будут храниться при -80 °С непосредственно до проведения анализа. Для отработки методики будут отобраны образцы плазмы крови 10 интактных (здоровых) мышей и 10-ти мышей с индуцированным иммунодефицитом.
Экстракция липидов и жирных кислот
Экстракция липидов будет проводиться модифицированным методом (Vitali Matyash, Gerhard Liebisch, Teymuras V. Kurzchalia, Andrej Shevchenko, Dominik Schwudke, Lipid extraction by methyl-tert-butyl ether for high-throughput lipidomics. Journal of Lipid Research, Volume 49, Issue 5, 2008, Pages 1137-1146) с использованием смеси метил-трет-бутиловый эфир/метанол, который обеспечивает восстановление экстракции липидов на уровне 82–98% для 17 различных классов липидов (Seul Kee Byeon, Ju Yong Lee, Jin-Sung Lee, Myeong Hee Moon, Lipidomic profiling of plasma and urine from patients with Gaucher disease during enzyme replacement therapy by nanoflow liquid chromatography–tandem mass spectrometry, Journal of Chromatography A, Vol. 1381, 2015, Pages 132-139). Высушенный экстракт будет восстанавливаться в смеси ацетонитрил: метанол (1:9, об/об) и анализироваться методом обращенно-фазовой жидкостной хроматографии на колонках с сорбентом типа С18 в сочетании с тандемной масс-спектрометрией высокого разрешения с источником ионизации электрораспылением. Условия проведения анализа будут оптимизированы в ходе выполнения работы с помощью метода ответного отклика (SRM), в том числе с использованием стандартных образцов.
В качестве метаболитов кишечной микробиоты могут выступать кроме нелетучих жирных кислот, также аминокислоты и витамины, а также витаминоподобных веществ, таких как холин хлорид (витамин B4), 4-ПБК (4-парааминобензойная кислота), (витамин B10), липоевая кислота.
Экстракция аминокислот, витаминов и витаминоподобных веществ
Экстракция 22 свободных аминокислот без дериватизации будет производится из образца плазмы крови по методике (Lisa M. Walter, Marc-Olivier Deguise, Katharina E. Meijboom, Corinne A. Betts, Nina Ahlskog, Tirsa L.E. van Westering et al. Interventions Targeting Glucocorticoid-Krüppel-like Factor Branched-Chain Amino Acid Signaling Improve Disease Phenotypes in Spinal Muscular Atrophy Mice. EBioMedicine V. 31, P226-242, MAY 01, 2018).
Экстракции водорастворимых витаминов, таких как витамины группы B, таких как B1, B2, B5, холина хлорида (витамин B4), 4- пара-аминобензойной кислоты (4-ПБК), альфа-липоевой кислоты из плазмы крови будут осуществляться разбавленной муравьиной кислотой, содержащей внутренние стандарты данных витаминов или витаминоподобных веществ по методике (Khaksari, M., Mazzoleni, L. R., Ruan, C., Kennedy, R. T., & Minerick, A. R. (2017). Determination of water-soluble and fat-soluble vitamins in tears and blood serum of infants and parents by liquid chromatography/mass spectrometry. Experimental Eye Research, 155, 54-63). Жирорастворимые витамины, такие как витамин Е и D6 будут экстрагироваться из плазмы крови метанолом, содержащим также внутренние стандарты этих витаминов. Из супернатанта после центрифугирования они будут изолированы с помощью гексана с помощью трехстадийной жидкостной экстракции по методике (Khaksari, M., Mazzoleni, L. R., Ruan, C., Kennedy, R. T., & Minerick, A. R. (2017). Determination of water-soluble and fat-soluble vitamins in tears and blood serum of infants and parents by liquid chromatography/mass spectrometry. Experimental Eye Research, 155, 54-63).
Разработка методик качественного и количественного определения биомаркеров микробиоты кишечника (метаболитов бактерий в крови лабораторных животных, включая нелетучие жирные кислоты, витамины, витаминоподобные вещества аминокислоты и др.) в плазме крови лабораторных животных (мышей, в том числе для контрольной группы здоровых мышей и мышей с индуцированным иммунодефицитом), методом ВЭЖХ-МС и валидация этих методик
Нами будут разработаны методики качественного и количественного анализа биомаркеров микробиоты кишечника (метаболитов бактерий в крови лабораторных животных, включая нелетучие жирные кислоты, витамины, витаминоподобные вещества, аминокислоты) в плазме крови лабораторных животных (мышей, в том числе для контрольной группы здоровых мышей и мышей с индуцированным иммунодефицитом), методом ВЭЖХ-МС с использованием международных библиотек микробных маркеров биологических жидкостей для выявления взаимосвязи состава микробиоты человека с нозологическими состояниями для внедрения в медицинскую лабораторную практику при ранней диагностике заболеваний и нарушениях метаболизма. Для анализа микробиоты по маркерам сложных смесей жирных кислот, витаминов, витаминоподобных веществ и аминокислот в плазме крови животных предложен метод ВЭЖХ-МС. Этот метод позволяет при минимуме затрат на пробоподготовку и отсутствии необходимости дериватизации веществ проводить достоверный анализ содержания индивидуальных липидов микробных маркеров. При этом сводятся к минимуму потери определяемых компонентов смесей, а также существенно расширяется спектр определяемых компонентов. Применение метода ВЭЖХ-МС позволит минимизировать и опустить стадии подготовки образцов, что облегчит внедрение данного метода в рутинную лабораторную практику, в том числе и для быстро набирающего рост рынка персонифицированной медицины.
Разработка новой методики ВЭЖХ-МС определения биомаркеров специфических жирных кислот и других метаболитов (витаминов, витаминоподобных веществ, аминокислот и др.) в биологических жидкостях человека, в частности в крови, будет включать подбор эффективных наполнителей для колонок, отработку режимов хроматографирования на модельных составах, подбор состава элюентов (подвижная фаза определенного состава, взаимодействующая с адсорбентом хроматографической колонки, с помощью которой осуществляется хроматографическое разделение анализируемых веществ), анализ, подбор, адаптацию международных библиотек хроматографических данных о биомаркерах, таких как библиотека масс-спектров Национального Института Стандартов и Технологии США (5 тыс. сп или библиотека масс-спектров METLIN, полученных на квадруполь времяпролетных масс-спектрометрах, с целью создания собственной базы данных.
Для обеспечения возможности согласования масс-спектральных характеристик аналита с базами данных, упомянутых ранее, надежное липидное, аминокислотное, витаминное аннотирование требует сбора данных на уровне тандемной МС/МС. Однако, хотя разделение методом ВЭЖХ помогает идентифицировать изомеры липидов, витамины и аминокислоты и снизить сложность анализа, возможность регистрации данных тандемной МС/МС высокого разрешения ограничены количеством ионов-предшественников, которые можно выбрать для фрагментации во время хроматографического элюирования. Следовательно, невозможно получить все интересующие спектры МС/МС в одном анализе для сложных образцов. Из-за смещения концентрации эта стратегия часто пропускает важные виды липидов с низким содержанием. Важнейшей задачей является решение этих проблем. Мы предполагаем использовать обращенно-фазовую хроматографию на мелкозернистых сорбентах, которая хорошо подходит для разделения многих изомерных липидов, а также витаминов и аминокислот и является популярным выбором для профилирования плазменных, тканевых и клеточных липидов, водорастворимых и жирорастворимых витаминов и аминокислот. Метод ВЭЖХ разделения связан с использованием в качестве детектора масс-спектрометра высокого разрешения Agilent 6545 Q-TOF, разработанным для обеспечения широкого динамического диапазона и улучшенного разрешения независимо от скорости захвата. Мы планируем оценить полностью автоматический режим итеративного сбора данных Q-TOF MS/MS, в котором образец вводится несколько раз, а ионы-предшественники, ранее выбранные для фрагментации MS/MS, исключаются по мере поступления. Таким образом, липидный, витаминный и аминокислотный обзор плазмы крови может быть значительно улучшен. Использование масс-спектрометрии высокого разрешения дает не только информацию о классе липидов, витаминов и аминокислот, а также составе и группах, но и их обеспечивает однозначную идентификацию липидов, витаминов и аминокислот.
Для количественного определения свободных жирных кислот, водо- и жирорастворимых витаминов и аминокислот будут использованы соответствующие стандарты ВЭЖХ чистоты.
Будет проведена также валидация методов ВЭЖХ для нелетучих жирных кислот, витаминов и аминокислот с определением относительного стандартного отклонения (RSD) времени удерживания всех липидов, пределов обнаружения (LOD) и количественного анализа (LOQ).
Определение метаболического профиля кишечного микробиома мышей на основании масс-спектров идентифицированных метаболитов с применением статистического и биоинформационного анализа.
Для сопоставления масс-спектров идентифицированных метаболитов с кишечным микробиомом будут использоваться база данных Human Metabolome Database и библиотека MetaboAnalyst 5.0 для языка программирования R. Анализ данных будет проводиться на уровне спектров, карт пиков, списков обнаруженных веществ и списков семейств бактерий. Спектры пройдут предварительную фильтрацию и нормализацию амплитуд. Для идентификации биомаркеров патогенов будет использована библиотека масс-спектров Национального Института Стандартов и Технологии США (5 тыс. спектров фрагментации веществ для тройных квадруполей и ионных ловушек), а также библиотека масс-спектров METLIN, полученных на квадруполь времяпролетных масс-спектрометрах.
В целях выделения фенотипов микробиома и поиска биологического объяснения наблюдаемым процессам, данные по расположению пиков будут обработаны методом главных компонент (англ. principal component analysis) и методом частичного дискриминантного анализа (англ. partial least squares-discriminant analysis). После снижения размерности полученные значения будут кластеризованы с целью выделения фенотипов метаболома. Далее данные будут обработаны методами MetPA (Xia et al. 2010), и mummichog algorithm (Li et al. 2013) с целью выделения основных биохимических путей продукции обнаруженных веществ. На основе полученных данных будет проведен сравнительный анализ состава метаболитов в крови животных контрольной и тестовой группы с иммунодефицитными состояниями. Далее полученные спектры будут сопоставлены с базой данных химических веществ (hmdb, pubchem, chebi, kegg, metlin) с целью получения списков веществ и их концентраций. Будет проведен анализ методом metabolite set enrichment analysis (MSEA) (Xia et al. 2010), с целью повторного выделения биологических путей продукции обнаруженных метаболитов. На основе полученных данных будет проведена оценка различий предсказываемых микробных сообществ в контрольной и тестовой группах.
Валидация тест-системы метаболома кишечной микробиоты по биомаркерам крови на основе ВЭЖХ-МС на прямых данных о микрофлоре кишечника мышей, полученных с помощью стандартных микробиологических исследований и метагеномного анализ фекалий мышей путем секвенирования 16S рибосомальных РНК
Верификация микрофлоры кишечника, продуцирующего специфические метаболиты, обнаруживаемые в крови лабораторных животных, будет проведена с помощью стандартного микробиологического анализа и метагеномного анализа S16 рибосомальных РНК. Анализы будут проводиться на образцах фекалий лабораторных интактных и иммунодефицитных групп мышей.
Оба вида анализа основаны на образцах фекалий мышей, которые должны быть растворены в пептонной воде и гомогенизированы перед посевом на различные твердые питательные среды согласно (Zhou, Z., Wu, X., Kresak, A., Griswold, M., & Lu, Z. -. (2013). Peptide targeted tripod macrocyclic Gd(III) chelates for cancer molecular MRI. Biomaterials, 34(31), 7683-7693).Для проведения стандартного микробиологического анализа будет использоваться метод искусственного выращивания микробов на специальных средах. Метод состоит в способности аэробных бактерий и анаэробов расти в среде агаров при определенной температуре с образованием колоний и видимых при 5-ти кратном увеличении.
Для анализа метагенома кишечника человека будет использоваться ампликонное секвенирование коротких рибосомальных РНК (16S rRNA) согласно (Di Segni, A., Braun, T., BenShoshan, M., Barhom, S. F., Saar, E. G., Cesarkas, K., ... & Haberman, Y. (2018). Guided protocol for fecal microbial characterization by 16S rRNA-amplicon sequencing. JoVE (Journal of Visualized Experiments), (133), e56845). Идентификация на основе ПЦР использует амплификацию ПЦР в режиме реального времени (qPCR) области рРНК 16s для дальнейшего различения видов бактерий (Все бактерии, Staphylococcus, Enterococcus, энтеробактерии, Lactobacillus/Leuconostoc, Bifidobacterium, Группа Bacteroides/Prevotella, Группа Blautia coccoides, Группа Ruminococcus leptum, Clostridium Кластера I, Clostridium Кластера XI). На выходе будет получаться список семейств бактерий по образцам.
Анализ возможности тест-системы метаболома кишечной микробиоты по биомаркерам крови на основе ВЭЖХ-МС при иммунодефицитных состояниях у мышей и построение профилей биомаркеров, характерных для нормального и иммунодефицитного состояния мышей с использованием полученных данных
Будет проведен анализ возможности разработанной тест-системы метаболома кишечной микробиоты по биомаркерам крови на основе ВЭЖХ-МС при иммунодефицитных состояниях у мышей и построение профилей биомаркеров, характерных для нормального и иммунодефицитного состояния мышей с использованием полученных данных и созданы соответствующие базы данных. Метод будет проверен стандартными методами медицинской статистики. С помощью теоремы Байеса будет проведен анализ апостериорной вероятности детектирования патогенов или нежелательной микрофлоры, на основании измеренной чувствительности и специфичности теста. Будет проведена оценка метода с помощью ROC-кривой. Дополнительно к этому будут предложены регрессионные модели, оценивающие изменение состояние микрофлоры во времени.
Разработка схем персонифицированного лечения иммунодефицитных состояний по биомаркерам крови методом ВЭЖХ-МС на примере лабораторных моделей мышей
Будут разработаны схемы персонифицированного лечения иммунодефицитных состояний по биомаркерам крови методом ВЭЖХ-МС на примере лабораторных моделей мышей. В дальнейшем предполагается возможность адаптировать полученные результаты под физиологию человека и транслировать полученные результаты в клиническую практику. Для выполнения этого проекта будет разработан дизайн терапии, использующей тесты биомаркеров, которые будут разработаны в ходе исполнения Задачи 7, в качестве контрольных точек измерения. Далее будет оценена возможность терапии лабораторных животных по предложенной схеме.
В результате выполнения задач по проекту будет достигнуто развитие в университете исследований мирового уровня, выполнение разработок в интересах реального сектора экономики, формирование сквозного «бесшовного» процесса использования результатов научных исследований для создания инновационных продуктов и технологий. За счет проекта будет осуществлено развитие кадрового потенциала науки, поддержка молодых исследователей, развитие интеграции УрФУ с академическими институтами.