Проект направлен на создание синтетических подходов к дизайну новых умных-материалов (smart-materials) для задач регенерации кожных покровов и пролонгированной доставки (рилизинга) целевых биоактивных молекул: ингибиторов кворум сенсинга (ИКС, QS-ингибитор) и местных анестетиков. Предлагаемый к реализации проект состоит из трех ключевых программных модулей. Первый модуль посвящен декорированию структуры катионных и неионогенных ИКС посредством введения функциональных групп, влияющих на фундаментальные процессы молекулярного распознавания на мембранах бактериальных клеток. Проявляя сродство к целевым рецепторам, ИКС нарушают химическую коммуникации внутри клеточной колонии и не позволяют сформировать бактериальную пленку – один из главных факторов возникновения больничных суперинфекций.
Второй модуль связан с разработкой подходов к получению фотополимеризуемых биосовместимых гидрогелевых систем на основе сеток полиакриламида (ПААм). Ключевой особенностью создаваемых гидрогелевых систем будет их многослойность. При общей толщине порядка 5 мм, за счет последовательной фотополимеризации в присутствии витамина В2 (фотоинициатор) предлагается создание сэндвич-структуры из 3-4 слоев. Первый слой (гидрогель #1) состоит из ПААм гидрогеля с ПОМ {Мо132} (молекулярного темплата), предварительно ассоциированного с аналгетиком, антибиотиком (в катионной форме, тетрациклин и др.) и катионным ИКС, а также включает поверхностную хитозановую пленку (толщиной несколько мономолекулярных слоев и состоящую из чередующихся слоев хитозана и макроаниона {Мо132}), обращенную к ране. Следующий слой (гидрогель #2) может состоять только из ПААм или дополнительно включать в структуру ПОМ для контроля размера сетки. Данный слой выполняет тормозящую функцию, предотвращая преждевременный рилизинг компонентов из следующего слоя (гидрогель #3). Гидрогель третьего слоя по своей структуре повторяет гидрогель #1, однако, содержит менее сильный анестетик (или меньшую дозу), антибиотик (с меньшей концентрацией, чем в 1 слое; использование здесь антисептика нежелательно, т.к. на поздних стадиях это мешает грануляции регенерирующей ткани), а также ИКС в меньшей дозе, что призвано обеспечить плавный переход к следующему этапу регенерации тканей, когда вероятность развития бактериальных инфекций уже снижена, а болевые ощущения выражены слабее. Верхний, четвертый слой (гидрогель #4) представляет собой ПААм сетку, с включенными наночастицами TiO2, введение которых служит защите от светового воздействия на рану и обеспечивает защиту от контаминации за счет фотоиндуцированной окислительной деструкции микроорганизмов и вирусов, адсорбировавшихся на внешней поверхности гидрогеля.
В качестве базовых модельных анестетиков будут использованы актуальные сегодня препараты (в катионной форме) типа лидокаин, ультракаин, бупивакаин, а на роль антибиотика выбран – тетрациклин (в катионной форме). После отработки методик получения многослойных гидрогелевых систем с заданными параметрами рилизинга модельных соединений, будут проведены работы третьего модуля. Данный блок исследования посвящен изучению биологической активности синтезированных в ходе выполнения работ первого модуля ИКС на бактериальных культурах (Staphylococcus и др.) и на модельных организмах (рыбы Danio rerio, анализ общего биологического эффекта). На основе проведенных скрининговых экспериментов в условиях in vivo будут выбраны наиболее перспективные ИКС для включения их в состав многослойных гидрогелевых систем. Кроме того, будет изучен регенеративный эффект получаемых многослойных гидрогелевых систем в экспериментах по культивированию фибробластов in vitro и in vivo на лабораторных животных (мыши).
Таким образом, решаемая в проекте задача по решению проблемы персонифицированной медицины в области регенерации кожных и слизистых покровов является в полной мере актуальной, а предлагаемые синтетические подходы обладают достаточным уровнем научной новизны.
Ожидаемые результаты:
Ожидаемые в ходе реализации проекта результаты следует разделить на несколько блоков. Первый блок связан с разработкой фундаментальных подходов к дизайну супрамолекулярной структуры фотополимеризуемых полиакриламидных сеток посредством введения наноразмерного неорганического темплата {Mo132}, который представляет собой многозарядный макроанион, способный к рН-зависимой деструкции (интенсификация рилизинга при рН=7.4), кроме того, такой темплат может быть удален из сетки, оставляя поры соответствующего размера (3 нм). В результате введение полиоксометаллата (ПОМ) {Mo132}, предварительно ассоциированного с биоактивными препаратами в катионной форме (анестетик, антибиотик, QS-ингибитор), в структуру гидрогеля позволяет создавать системы пролонгированного рилизинга через универсальный протокол, практически вне зависимости от природы доставляемого лекарства. Такая «универсальность» служит практической значимости и доступности технологии изготовления гидрогелей. Использование концепции многослойности также служит этой цели, так как позволяет независимо настраивать целевые свойства каждого слоя, исходя из его специфической нагрузки: предотвращение развития резистентных бактериальных инфекций, обезболивание, защита от контаминаций и механического повреждения. Возможность тонкой настройки супрамолекулярной структуры гидрогеля в каждом слое имеет большое значение с научной точки зрения, так как за частую формирование трехмерной полимерной сетки носит статистический характер, что нивелирует специфичность взаимодействий с живыми тканями организма каждого из компонентов гидрогеля.
Результаты второго блока относятся с синтетической органической химии и связаны с декорированием структуры ингибиторов кворум сенсинга (ИКС, QS-ингибитор) в катионной и неионогенной формах. Фокус проводимых в рамках проекта исследований направлен не на антибиотики, а на ИКС, как на крайне перспективную и актуальную альтернативу борьбы с бактериальными инфекциями взамен стратегии поиска все более мощных антибиотиков. Обнаруженный в конце 20-века эффект влияния коммуникации между бактериальными клетками на процесс формирования защитной биопленки, обеспечивающей резистентность штаммов даже к сильным антибиотикам, позволил говорить о принципиально новом подходе в борьбе с суперинфекциями. В ходе реализации проекта планируется провести синтез новых ИКС на основе базовых структур с целью установления фундаментальной связи «структура-свойства» посредством экспериментов in vitro на бактериальных колониях. Таким образом, важность ожидаемых результатов от реализации данного этапа проекта связана с возможностью выявления ключевого структурного фрагмента в молекулах ИКС, определяющего аффинность молекул ингибитора к мембранным рецепторам различных бактериальных штаммов. В свою очередь, это является критической точкой роста для создания ИКС следующего поколения. Кроме того, концепцию ингибирования межклеточной коммуникации можно прогностически транслировать на процессы разрушения макрофагального (макрофаги 2-типа) защитного окружения раковых клеток, открывая возможность для формирования нормального иммунного ответа. В рамках синтетического блока также ожидается получение тио-производных ксантеновых красителей, которые можно ковалентно иммобилизовать в полимерной сетке гидрогеля. В этом контексте введение ПОМ {Mo132} носит дополнительный смысл, так как позволяет сформировать систему с обратной связью. А именно, как нами было ранее показано, на поверхности {Mo132} происходит тушение флуоресценции молекул родамина-Б, которая возвращается на исходный уровень при деструкции ПОМ. Таким образом, комбинирование в структуре гибридного гидрогеля кеплератов {Mo132} и флуоресцентных красителей позволит оценить остаточную концентрацию препаратов, ассоциированных с ПОМ, по мере процесса рилизинга. Данный результат имеет большое значение, так как позволяет проводить индивидуальный мониторинг фармакокинетики у пациента и определить момент замены регенерирующей повязки.
Следующим важным результатом проекта по созданию многослойных гидрогелей являются подходы к управлению функциональной нагрузкой терминальных слоев, обращенных к ране (гидрогель #1) или к внешней поверхности повязки (гидрогель #4). На сегодняшний день существует определенное количество работ, посвященных созданию гибридных слоев на основе полиоксометаллатов и катионных полиэлектролитов, однако, среди них нет работ, посвященных интерфейсам «гидрогель/живая ткань». Введение Кеплерата в гидрогель #1 позволяет создать на его поверхности тонкий адгезивный слой из хитозана, который связан с полиакриламидной сеткой через макроанионы {Mo132}. Когда необходимо удалить регенерирующую повязку, то достаточно будет воздействовать на место контакта с раной слабощелочным раствором (рН в районе 8.4) и хитозановый слой, в который уже встроились клеточные структуры, отделиться от полиакриламидной основы из-за деструкции ПОМ. В результате смена повязки будет малоинвазивной и не будет негативно сказываться на динамике регенерации раны.
Кроме того, в рамках синтетических подходов планируется привить неионогенные ИКС к хитозановому слою через лабильные имидные связи (pH-cleavable), основания Шиффа, которые способны к обратимому кислотному гидролизу в области рН=6, что соответствует кислотности раны на первых этапах ее регенерации. В результате интенсивность процесса рилизинга таких ИКС будет напрямую связана со степенью заживления раны, уменьшаясь по мере формирования кожного покрова. Последнее можно отнести к задачам тераностики – подхода, который лежит в основе ряда современных концепций персонифицированной медицины.
Возвращаясь к терминальным слоям гидрогелевой системы, предлагаемый дизайн верхнего слоя (гидрогель #4) предполагает введение диоксида титана, который коммерчески доступен в форме наночастиц (P25). Создание такого композитного слоя служит не только улучшению механической прочности системы, но и позволит обеспечивать дополнительную защиту от заражения вирусными или бактериальными инфекциями посредством окислительной деструкции контаминирующих агентов свободно-радикальными формами кислорода на поверхности TiO2.
На ряду с передовыми подходами борьбы с бактериальными инфекциями и способом предотвращения контаминации раны, сама концепция создания многослойных гидрогелей также заслуживает внимания. Создание такой сэндвич-структуры будет проводиться последовательно в разборной кювете слой за слоем. Такой процесс возможен благодаря фотополимеризации акриламида и сшивающего агента в присутствии фотоинициатора – рибофлавина (витамин B2) под действием мягкого УФ (365-400 нм). Все компоненты указанной смеси являются полностью биосовместимыми. При этом, возможно как формирование структуры полиакриламидной сетки in situ, т.е. при совместной полимеризации акриламида и сшивающего агента, так и введение в систему полиакриламида заданной молекулярной массы, что позволит варьировать эластичность гидрогеля.
В дополнение к синтетическому аспекту в проекте планируется получить результаты по общей биологической активности синтезированных ИКС на модельных животных – рыбах Danio Rerio. Наряду с результатами скрининговых экспериментов по активности ИКС на бактериальных штаммах и опытами по культивированию фибробластов человека на синтезируемых гидрогелях, это позволит создать многослойную гидрогелевую регенерирующую повязку с большим потенциалом для реального использования на практике.
Таким образом, в результате послойного дизайна будет получена легко-сменяемая гидрогелевая повязка, способная стимулировать рост новых кожных покровов, сопровождая процесс регенерации рилизингом ИКС, антибиотика и местных анестетиков (уже применяющихся в клинической практике), а также обеспечивая плавный переход к поздним этапам заживления, индикацию времени замены (флуоресцентный отклик) и протекторную функцию от контаминаций и механических повреждений.
С одной стороны, подобные системы относятся к передовым средствам персонифицированной медицины, с другой стороны, несмотря на высокую наукоемкость предлагаемых подходов, позволяют использовать простые технологические решения для производства и масштабирования реальных изделий. В совокупности с фундаментальной составляющей проекта, к которой относится темплатный дизайн супрамолекулярной структуры гидрогеля, создание комплементарного окружения в полимерной сетке для гостевых молекул (ИКС, антибиотик, анестетик), и поиск связи «структура-свойства» новых ИКС, ожидаемые результаты соответствуют международному уровню исследований в указанных областях и будут востребованы и актуальны как для научных работников, так для специалистов из реального сектора экономики. Возможность практического использования ожидаемых результатов проекта имеет большое значение для реализации социально-значимой стратегии по внедрению средств персонифицированной медицины и поиску более эффективных способов борьбы с суперинфекциями.